PCR : ÉlectrophorèseVisualiser le résultat de votre amplification d'ADN
Les différentes étapes d'une électrophorèse sur gel
Une fois l'étape d'amplification par PCR terminée, il est nécessaire de réaliser une électrophorèse afin de visualiser vos résultats.
L'amplification a permis d'obtenir des fragments d'ADN de taille déterminée. Ces fragments vont être déposés sur un gel d’agarose et migrer selon leur taille et leur point isoélectrique. La révélation sera réalisée à l’aide d’un colorant éclairé autour de 470 nm.
Réalisation d'un gel d'agarose
Les fragments d’ADN compris entre une centaine et quelques milliers de paires de base peuvent être séparés au sein d’un gel composé de tampon de migration et d’agarose.
Le tampon de migration le plus couramment utilisé en laboratoire est le Tris Acétate EDTA (TAE) qui, chargé en ions, va permettre de "tracter" l’ADN au sein du gel sous l’effet du champs électrique du pôle – vers le pôle +.
Le TAE est généralement conditionné dans des flacons de 100 ml et concentré à 10X. Il faut le diluer à 1X avec de l’eau distillée pour réaliser une électrophorèse. Attention, utilisez le même tampon pour le gel et le tampon de migration dans la cuve.
Par exemple, pour préparer 200 ml de tampon TAE 1X, mélangez 20 ml de TAE 10X et 180 ml d’eau distillée. 15 ml seront nécessaires pour réaliser le gel, les 185 ml restant pourront servir à la migration du gel dans la cuve.
Il existe également d’autres tampons de migration comme le Tris Borate EDTA (TBE) ou le tampon TGV pour faire migrer de l’ADN, de l’ARN ou des protéines qui repose sur les mêmes principe.
L'agarose va servir à créer un maillage dans le gel. Plus le pourcentage d’agarose dans la gel est élevé plus le maillage est serré et inversement. Les fragments d’ADN seront alors ralentis suivant leur taille.
| TAE 1X | Agarose | |
|---|---|---|
| 0.8 % | 15 ml | 0.12 g |
| 1 % | 15 ml | 0.15 g |
| 1.5 % | 15 ml | 0.23 g |
| 2 % | 15 ml | 0.3 g |
| 3 % | 15 ml | 0.45 g |
Pour faciliter la réalisation du gel, Jeulin a développé une plaque de coulage (réf. 527024) adaptée au système électrophorèse ADN et protéine (réf. 591059) et
une système de coulage (réf. 708250) adaptée au système d’électrophorèse phorEasy® (réf. 708150)
Pré-coloration du gel d'agarose
Le développement de colorants d’ADN sans danger, type GelGreen™, à intégrer directement dans le gel au moment de sa préparation permet une révélation immédiate par simple rétroéclairage avec le transilluminateur.
En plus du confort d'une lecture immédiate, le niveau de détection est très nettement supérieur au colorant classique (type azure A), la fluorescence révélant de très faibles quantités d'ADN. Plus besoin de bain de coloration !
Ajouter 1 µl de GelGreen™ 2 à 3 min après avoir fait chauffer votre solution tampon/agarose. Le gel encore liquide prend une teinte orangée. Coulez le gel et laissez solidifier. Le gel est prêt à recevoir les fragments d’ADN.
Dépôts des fragments d'ADN amplifiés dans le gel d'agarose
Le dépôt des produits d'amplification dans les puits du gel est une étape minutieuse.
Le premier puit est généralement utilisé pour l'échelle de poids moléculaire. Suivant le système d'électrophorèse que vous utilisez, vous pouvez faire votre dépôt directement dans la cuve ou alors sortir le support sur la paillasse, réaliser les dépôts successif et remettre le support en place. Le tampon de charge présent dans le milieu réactionnel va permettre de maintenir le dépôt au fond du puit.
Entre 8 µl et 10 µl d'ADN sont nécessaires par puit. Le dépôt est une étape importante. Si de l'ADN reste dans la pointe de la micropipette ou sort du puit pendant le dépôt, le résultat de l'électrophorèse sera biaisé (bandes moins colorées ou absente).
La migration
La migration se fait à l'aide d'un générateur. Cette alimentation peut être externe à relier à la cuve ou interne pour les systèmes d'électrophorèse compacts type phorEasy®.
En fonction de la taille de la cuve, le voltage devra être adapté. Plus la distance entre les deux électrodes sera grande plus vous aurez besoin d'un voltage important.
Le gel doit être immergé sous 3 à 5 mm de tampon de migration. Attention, il ne faut pas mettre trop de tampon car cela diminue la résistance entre les 2 électrodes et peut engendrer un ralentissement de la migration, une surchauffe et une distorsion des bandes.
Le temps de migration va dépendre du système d'électrophorèse utilisé, de 15-20 min pour les systèmes compacts à 45-75 min pour les systèmes classiques.
En fonction de la taille de la cuve, le voltage devra être adapté. Plus la distance entre les deux électrodes sera grande plus vous aurez besoin d'un voltage important.
Le gel doit être immergé sous 3 à 5 mm de tampon de migration. Attention, il ne faut pas mettre trop de tampon car cela diminue la résistance entre les 2 électrodes et peut engendrer un ralentissement de la migration, une surchauffe et une distorsion des bandes.
Le temps de migration va dépendre du système d'électrophorèse utilisé, de 15-20 min pour les systèmes compacts à 45-75 min pour les systèmes classiques.
La révélation
Si vous avez pré-coloré votre gel avec du colorant GelGreen™ vous pouvez directement réaliser l'étape de la révélation à l'aide d'un transilluminateur qui va révéler par fluorescence l'ADN migré. Dans le cas contraire, le marquage de l'ADN devra être réalisé par des bains successifs avec des colorants spécifiques tels que le bleu de méthylène ou l'azura A.
Avec le système d'électrophorèse phorEasy®, le transilluminateur est directement intégré. La révélation peut se faire en temps réel. Pour les systèmes classiques, vous devrez vous équiper d'un transilluminateur.
Retrouvez sur notre site le transilluminateur et la chambre noire développés par Jeulin pour une révélation optimale de vos résultats.
Retrouvez sur notre site le transilluminateur (réf. 527044) et la chambre noire (réf. 527044) spécifiquement développés par Jeulin pour une révélation optimale de vos résultats.
Notre sélection de systèmes d'électrophorèse proposés par Jeulin
Notre sélection de systèmes d'électrophorèse proposés par Jeulin
Kits pédagogiques pour l’enseignement
Vous pouvez retrouver sur notre site tous nos kits PCR et d’ADN prêt à déposer conçus et fabriqués dans notre laboratoire à Évreux, Normandie.
Ces kits sont conçus sur des thèmes des programmes scolaires et élaborés à partir de publications scientifiques en collaboration avec des chercheurs de différents instituts français.
Aucun résultat obtenu de manière détourné ! le matériel fourni dans nos kits permet de réaliser un véritable expérience de PCR comme en labo.
Consulter notre offre complète de kits pédagogiques pour l’enseignement
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